Real-Time PCR in der Diagnostik
PCR – Polymerase Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion[1]; [2] (engl. Polymerase chain reaction – PCR) ist eine der wichtigsten Techniken der Molekularbiologie und wurde im Jahr 1983 von Kary B. Mullis entdeckt, wofür er 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt. Grundlage ist ein in-vitro Verfahren, welches innerhalb kürzester Zeit die spezifische Vervielfältigung bestimmter DNA Sequenzen ermöglicht. In unterschiedlichsten Bereichen der biologischen Forschung, sowie der medizinischen Diagnostik ist diese Methode nicht mehr wegzudenken.
Welche Varianten der PCR existieren?
Vielfalt der PCR-Technologie
Aufgrund der vielen Anwendungsbereiche wurden unterschiedliche Varianten[2] der PCR-Technologie entwickelt.
Nachfolgend ist eine Auswahl dieser Optimierungen aufgeführt:
Das Verfahren der quantitativen PCR ermöglicht in Echtzeit die mengenmäßige Bestimmung des vervielfältigten, genetischen Materials durch den Einsatz von fluoreszenzmarkierten DNA-Oligonukleotiden. Die Quantifizierung erfolgt durch Fluoreszenz-Signale, die entweder unspezifisch durch in doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoffe (z.B. SYBR Green) oder durch spezifisch an DNA-Einzelstränge bindende Hydrolyse-Sonden (z.B. TaqMan) generiert werden.
Diese Weiterentwicklung der klassischen PCR umfasst neben der eigentlichen DNA-Vervielfältigung zunächst einen reversen Transkriptions-Schritt, in dem RNA durch die reverse Transkriptase in komplementäre DNA transkribiert wird. Anschließend erfolgt in einem zweiten Schritt die Vervielfältigung dieser DNA. Finden beide Schritte in einem einzelnen Reaktionsgefäß statt, spricht man von einem „one-step“ Verfahren – sind beide Reaktionen durch zwei aufeinanderfolgende Schritte voneinander getrennt, handelt es sich um eine „two-step“ Technologie. Die Form der PCR wird z.B. für den Nachweis von RNA-Viren und für Expressionsstudien verwendet.
Eine sehr leistungsstarke Methode stellt die Multiplex PCR dar, welche den Nachweis von unterschiedlichen Ziel-Sequenzen innerhalb eines einzelnen PCR-Ansatzes ermöglicht. Die Differenzierung der verschiedenen Produkte kann entweder über die Größe der entstandenen DNA-Moleküle oder durch Verwendung von spezifischen Hydrolyse-Sonden mit unterschiedlichen Fluorophoren erfolgen.
Mit der sequenzspezifischen PCR können Einzelnukleotid-Polymorphismen nachgewiesen werden. Dies wird durch die Verwendung von Primern oder Sonden ermöglicht, die sich mit ihrem 3‘ Ende nur an den Ziel-Polymorphismus spezifisch anlagern.
Die „Hot start“ PCR erfolgt unter Verwendung eines speziell modifizierten Polymerase-Enzyms, das z.B. durch die Bindung eines spezifischen Antikörpers gehemmt ist und erst durch Erhitzen auf 95°C aktiviert werden muss. Durch diese Modifikation werden Spezifität und DNA-Ausbeute erhöht, indem eine unspezifische DNA-Amplifikation zu Beginn einer PCR reduziert wird.
Spezifische Real-Time PCR (quantitativ)
Ausgangsmaterial für die PCR
Ausgangsmaterial für die Vervielfältigung, beziehungsweise Amplifikation von DNA mittels Real-Time PCR, sind doppelsträngige DNA-Moleküle, die im Blut oder Schleimhäuten eines Organismus vorliegen. Die Amplifikation sowie spezifische Detektion der entstandenen PCR-Produkte erfolgt bei dieser Methodik in Echtzeit und vollständig automatisiert in einem Thermocycler.[3]–[5]
Die benötigten Komponenten sind:
- freie Nukleotide
- sequenzspezifische Primer
- thermostabile Polymerase mit Exonuklease-Aktivität
- sequenzspezifische TaqMan Sonde
- genetisches Probenmaterial in Form von doppelsträngiger DNA
Ablauf
Vor dem Start der PCR-Reaktion liegt die TaqMan Sonde, die später eine spezifische Detektion über Fluoreszenz ermöglicht, intakt vor.
In diesem Zustand findet aufgrund der räumlichen Nähe des Reporter Fluorophors (R) zu einem Quencher (Q) zwischen diesen Molekülen ein als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) bezeichneter Prozess statt, der dazu führt, dass das Fluoreszenzsignal des Reporter Fluorophors bei dessen Anregung unterdrückt wird.
Im Allgemeinen ist ein PCR-Protokoll aus den drei grundlegenden Schritten Denaturierung, Annealing und Extension aufgebaut.
Denaturierung
Der erste Schritt einer PCR ist das „Aufschmelzen“ der DNA-Doppelstränge in Einzelstränge durch eine Erhöhung der Temperatur. In der Regel erfolgt dieser Prozess bei 90 – 97 °C, wobei sich ein hoher GC-Gehalt im Target DNA-Strang auf die benötigte Denaturierungszeit auswirkt und höhere Temperaturen erfordert.
Annealing
In dieser Phase wird die Reaktions-Temperatur gesenkt, sodass Sonden und Primer sich komplementär an die vorliegenden DNA-Einzelstränge anlagern, beziehungsweise mit diesen hybridisieren können. Das Fluoreszenzsignal des Reporter-Fluorophors der TaqMan Sonde wird durch die räumliche Nähe zum Quencher und den folglich vorliegenden Quenching-Effekt weiterhin unterdrückt.
Extension
Während diesem PCR-Schritt wird die Reaktionstemperatur an das Aktivitätsoptimum der Polymerase angepasst, welche an das 3‘ Ende der hybridisierten Primer bindet und freie Nukleotide komplementär zum vorliegenden DNA-Strang anfügt. Sofern die TaqMan Sonde spezifisch gebunden hat und die Polymerase mit 5‘-3‘ Exonukleaseaktivität auf das 5‘ Ende der TaqMan Sonde trifft, wird diese unter Anwesenheit von Wasser gespalten (hydrolyisiert). Dies führt zu einer räumlichen Trennung von Reporter-Fluorophor (R) und Quencher (Q), infolgedessen der Quenching-Effekt aufgehoben wird. Eine Anregung des Reporters führt nun zur Lichtemission, die durch die Detektionseinheit des Thermocyclers erfasst werden kann.
Vervielfältigung
Die einmalige Abfolge von Denaturierung, Annealing und Extension wird als ein Zyklus bezeichnet, in dem ein DNA-Doppelstrang unter optimalen Reaktionsbedingungen verdoppelt wird. Ein PCR-Protokoll umfasst in der Regel bis zu 40 Zyklen.
Fluoreszenz-Emission
Die Fluoreszenz-Emission, des durch eine Lichtquelle angeregten Reporter-Fluorophors, korreliert quantitativ mit der entstandenen Menge an Amplifikaten und wird in Echtzeit durch den Thermocycler in Form einer Amplifikationskurve aufgetragen. In der exponentiellen Phase verdoppeln sich die PCR-Produkte wie zuvor beschrieben, wobei ein entsprechender Anstieg des Fluoreszenz-Signals erst detektierbar ist, wenn das Hintergrundsignal überschritten wird.
Der Zyklus, bei dem das Fluoreszenzsignal der Reaktion einen Schwellenwert überschreitet, wird als Schwellenzyklus* bezeichnet. Der Schwellenwert kann entweder auf einen festen Wert, wie zum Beispiel 200 relative Fluoreszenz-Einheiten/-Units (RFE/RFU), festgelegt oder automatisch durch eine Software kalkuliert werden. Die Verdopplung der Amplifikationsprodukte von Zyklus zu Zyklus entspricht einer 100%igen Effizienz und wird nach einer gewissen Zeit durch verschiedene Faktoren beeinflusst.
PCR Kurve
Primer oder freie Nukleotide liegen nicht mehr im Überschuss vor und die DNA-Polymerase verliert an Aktivität, es können inhibierende Metabolite entstehen und/oder die Denaturierung wird ineffizienter. Dadurch kommt es schließlich zur Plateau-Phase, in der sich die Amplifikation nahezu vollständig einstellt.
Vorteile unserer qPCR-Produkte
Wir kombinieren verschiedene PCR-Innovationen, um vor allem sichere, effiziente und anwenderfreundliche Diagnostikprodukte zu entwickeln.
- leistungsstark durch Multiplexing
- sichere Ergebnisse durch interne Amplifikationskontrolle
- geringe DNA-Konzentrationen für Analysen ausreichend
- kurze Analyse-Zeiten
- einfaches Setup
- hoher Automatisierungsgrad
- Echtzeit-Monitoring
- kein Arbeiten mit toxischen Gelen und kein anderer toxischer Müll
- one step Verfahren für reverse Transkriptase PCR
- anwenderfreundliche Software-Lösungen für die Auswertung
Anwendungsgebiete in der Diagnostik
Die Methodik der qPCR wird in der Routinediagnostik7, während der Nachtschicht und im Forschungsbereich für die unterschiedlichsten Fragestellungen eingesetzt:
Genotypisierung
Welche Blutgruppe liegt vor?
Transfusionsdiagnostik
Sind Spender und Empfänger bei einer Organtransplantation kompatibel?
Transplantationsdiagnostik
Liegen genetische Prädispositionen für eine Erkrankung vor?
Humangenetik
Grundlagenforschung
Wo, wann und unter welchen Bedingungen erfolgt die Expression von Genen?
Expressionsanalysen
Viraldiagnostik
Liegt eine virale Erkrankung vor?
- Hepatitis A Virus
- Herpes Simplex Virus
- COVID-19
Fragen zur Real-Time PCR?
Hier bekommen Sie Antworten! Kontaktiere Sie uns gerne per E-Mail oder rufen Sie einfach an. Wir freuen uns auf einen interessanten Erfahrungsaustausch.
Zusätzlich bieten wir auch kostenfreie Online-Workshops oder Präsenztermine an. Bleiben Sie auf dem Laufenden.
Bibliography
1 Mullis, K. B. (1990): The unusual origin of the polymerase chain reaction. In: Scientific American 262 (4), 56-61, 64-5. DOI: 10.1038/scientificamerican0490-56.
2 Maheaswari, Rajendran; Kshirsagar, Jaishree Tukaram; Lavanya, Nallasivam (2016): Polymerase chain reaction: A molecular diagnostic tool in periodontology. In: Journal of Indian Society of Periodontology 20 (2), S. 128–135. DOI: 10.4103/0972-124X.176391.
3 Applied Biosystems®, life technologies™: Real-time PCR handbook. Basics of real-time PCR. In:. Online https://www.thermofisher.com/, zuletzt geprüft am 13.05.2020.
4 Joshi, Mohini; Deshpande, J. D. (2011): POLYMERASE CHAIN REACTION: METHODS, PRINCIPLES AND APPLICATION. In: Int Jour of Biomed Res 2 (1). DOI: 10.7439/ijbr.v2i1.83.
5 Calculations for Molecular Biology and Biotechnology (2016): Elsevier.
6 Deepak, S. A.; Kottapalli, K. R.; Rakwal, R.; Oros, G.; Rangappa, K. S.; Iwahashi, H. et al. (2007): Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. In: Current Genomics 8 (4), S. 234–251.
7 Holzapfel, Bianca; Wickert, Lucia (2007): Die quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR). Methoden und Anwendungsgebiete. In: Biol. Unserer Zeit 37 (2), S. 120–126. DOI: 10.1002/biuz.200610332.
